一、腈水合酶酶简介

腈水合酶(Nitrile hydratase, NHase)是一类作用于腈类化合物碳氮三键，生成相应的酰胺类化合物的金属酶。

腈水合酶一般由α和β两个亚基组成，其基因簇下游通常还存在一个帮助其摄取金属离子的激活蛋白，以促进腈水合酶的成熟。根据酶活性中心结合金属离子的差异，腈水合酶分为钴型腈水合酶(Co-NHases)和铁型腈水合酶(Fe-NHases)，分别结合了三价低自旋的非咕啉钴和三价低自旋的非卟啉铁[1-4]。

不论是Co-NHase还是Fe-NHase，腈水合酶都含有高度保守的氨基酸序列(Cys-X-X-Cys-Ser-Cys)，能够形成“爪状”结构，并与金属离子特异性结合，构成活性中心。而Co-NHase与Fe-NHase的不同点在于Co-NHase爪状结构正上方为水分子，而Fe-NHase则为一氧化氮分子[5]。

实例1、合成酰胺 [6]

酰胺类产品在工业、农业及医药等领域有着极大的应用价值。丙烯酰胺和烟酰胺等小体积酰胺化合物可作为大宗化学品，而大体积酰胺类化合物通常是高价值药品的原料和医药中间体(见图1)。

实例2、与酰胺酶偶联生成异羟肟酸[7]

在医药领域，异羟肟酸化合物可用于治疗癌症、关节炎、哮喘、机体溃烂等疾病[8]。

NHase作为绿色生物催化剂，在合成酰胺类化合物方面具有诸多优势：①反应没有副产物形成；②反应为一步酶法，工艺简单；③反应条件温和。

二、腈水合酶催化机理[9]

目前，认可度较高的腈水合酶催化机理有四种(机理1-4)，除了机理4是基于P. thermophila JCM 3095 腈水合酶与底物的复合晶体结构数据进行推测的，其余机理均是直接介于水分子参与的推测。

机理1、内球机制

底物氰基上的氮原子与酶活性中心的金属离子形成配位键，水分子作为亲核试剂直接进攻底物氰基上的碳原子，形成酰胺键(见图2)。

机理2、外球机制

水分子在腈水合酶的活性中心被极化，解离出氢氧根离子。该氢氧根离子与金属离子配位后，攻击底物氰基上的碳原子，生成了过渡态产物(R-C(-OH)=NH)。最后，过渡态产物重排后得到酰胺产物(见图3)。

机理3、次外层机制

和外球机制不同，氢氧根离子与金属离子配位后，会先活化附近的水分子，再通过该水分子的羟基亲核攻击底物。在该过程中，金属离子的配位层不发生变化(见图4)。

机理4、基于腈水合酶与底物复合晶体结构建立的机制

腈水合酶中的第113位半胱氨酸残基被氧化为半胱氨酸-次磺酸后，会亲核攻击与金属离子配位的底物，形成过渡态产物(R-C(-OH)=NH)中间体。该中间体一旦发生质子转移，过渡态产物上的碳原子(pathway A)或αCys113(pathway B)在受到水分子的亲核攻击时，最终异构化为酰胺(见图5)。

三、Z6·尊龙凯时生物腈水合酶酶库和酶开发服务介绍

Z6·尊龙凯时生物从2007年来就专注于生物酶和生物催化技术以及合成生物学技术的开发与应用研究。Z6·尊龙凯时生物现有的腈水合酶酶库(Z6·尊龙凯时生物代号：ES-NHT)中包含24种不同的腈水合酶，可以为客户提供酶筛选、酶促反应工艺优化、酶改造和生产供应服务。

四、参考文献

[1] Nagashima S, Nakasako M, Dohmae N, et al. Nature Structural Biology, 1998, 5(5): 347.

[2] Miyanaga A, Fushinobu S, Ito K, et al.European Journal of Biochemistry, 2004, 271(2): 429-438.

[3] Arakawa T, Kawano Y, Kataoka S, et al.Journal of Molecular Biology, 2007, 366(5): 1497-1509.

[4] Brodkin H R, Novak W R, Milne A C, et al.Biochemistry, 2011, 50(22): 4923-4935.

[5] Song L, Wang M, Shi J, et al.Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 362(2): 319-324.

[6] 郭军玲, 高性能腈水合酶的挖掘及半理性改造. [D] 无锡: 江南大学, 2023.

[7] Vojtech V., Ludmila M., Alicja B. V., e tal. J Mol Catal B-enzym, 2011,71: 51-55.

[8] 曾文彬, 异羟肟酸类衍生物的设计、合成、结构分析及抗肿瘤活性研究. [D] 江西:南昌大学, 2013.

[9] 马东, 基于半理性设计改造腈水合酶的底物谱和催化性能. [D] 无锡: 江南大学, 2024.